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021-54845833/15800441009
花生過敏原Ara H1(Arah1)ELISA試劑盒
簡介
5α-還原酶(Arah1) 是花生中最主要的過敏原蛋白，占花生總蛋白的12%-16%，分子量為63.5 kDa，屬于豌豆球蛋白類，具有高度的致敏性和熱穩(wěn)定性。Ara H1是花生過敏患者血清中識(shí)別率最高的過敏原蛋白，超過90%的花生過敏患者對(duì)其產(chǎn)生特異性IgE反應(yīng)。Ara H1的致敏性主要與其IgE結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，這些位點(diǎn)通常位于蛋白質(zhì)的疏水性殘基區(qū)域。Ara H1的致敏性主要與其IgE結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，這些位點(diǎn)通常位于蛋白質(zhì)的疏水性殘基區(qū)域。研究表明，Ara H1可以通過可重復(fù)的熒光法形成穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有助于其與IgE結(jié)合。
本試劑盒Arah1免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的Arah1。試劑盒包含大腸桿菌表達(dá)重組Arah1和針對(duì)重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然Arah1獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測定天然Arah1的相對(duì)質(zhì)量值。
檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù)：將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物Arah1，孵育清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍(lán)色，則加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中Arah1的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時(shí)包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先從640ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至32ng/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的32ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將32ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。
一抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如樣本中待測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80% - 120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.25ng/mL。
線性關(guān)系
分別在選取的4份健康血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度Arah1，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。
本ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)計(jì)算和曲線圖，請(qǐng)您下載產(chǎn)品說明書(供參考），本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
