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021-54845833/15800441009
簡介
套膜蛋白（Involucrin，簡稱INV）是一種在皮膚角質(zhì)形成細胞中表達的蛋白質(zhì)，主要參與皮膚屏障的形成和維持，與兜甲蛋白（Loricrin）和絲聚合蛋白（FLG）等共同構(gòu)成角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)，通過轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGM1）的作用與其他蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成角質(zhì)層的物理屏障。套膜蛋白（INV）在皮膚屏障功能中起著關(guān)鍵作用，其含量高低直接影響皮膚屏障功能的強弱。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù) : 將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物INV，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本中INV的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測），或-80℃（6個月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
試劑準(zhǔn)備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先從1.6μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至80ng/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的80ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將80ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測樣本中INV濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
結(jié)果的計算
計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)
80
40
20
10
5
2.5
1.25
0
OD值
2.407
1.666
1.009
0.705
0.454
0.284
0.15
0.067
校正OD值
2.34
1.599
0.942
0.638
0.387
0.217
0.083
0.0
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實驗者需根據(jù)自己的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計算應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計算樣本結(jié)果
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.63ng/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組人INV。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
