產(chǎn)品及特點
秀麗隱桿線蟲是重要的模式生物，是研究多細胞真核生物細胞和分子生物學的材料。秀麗隱桿線蟲有6對染色體，每條染色體都有端粒，其序列為TTAGGC，跟哺乳動物的端粒TTAGGG非常相似，其長度由端粒酶維持。目前最常用的檢測端粒酶活性的方法就是TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol，端粒重復片段擴增)，它利用端粒酶能在底物DNA末端添加不同數(shù)量的序列這一特點，通過PCR檢測延伸產(chǎn)物而高效檢測端粒酶活性。但是傳統(tǒng)的TRAP方法為終點電泳檢測法，靈敏度低，沒法定量，同時還容易產(chǎn)生氣溶膠污染。為克服這些缺點，本公司開發(fā)了基于探針法qPCR的TRAP試劑盒。它具有以下特征：
1. 即開即用，提供從細胞裂解到qPCR所有試劑，免去自己優(yōu)化條件。
2. 基于探針法熒光定量PCR，比電泳法TRAP靈敏度高。
3. 使用探針，專一性比電泳法TRAP高。
4. 提供陽性對照，可以進行基于此對照的定量分析。
5. 一管式操作，免去氣溶膠污染之憂。
6. 既可用于定量，又可用于定性。用于定量時線性范圍至少有5個數(shù)量級。
7. 既可用于培養(yǎng)細胞，也可用于實體組織（包括腫瘤組織）。
8. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的TRAP PCR檢測。
9. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分
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規(guī)格
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包裝
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TRAP專用細胞裂解液
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10mL
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10mL本色瓶
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2×TRAP專用qPCR MasterMix
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0.5mL
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0.5mL本色蓋
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1.0mL
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1.5mL綠色蓋
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秀麗隱桿線蟲TRAP檢測陽性對照（1E7拷貝/μL）
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50μL
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0.5 mL黃色蓋
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秀麗隱桿線蟲端粒酶底物干粉
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50次
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0.5 mL白色蓋
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秀麗隱桿線蟲TRAP引物-探針干粉
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50次
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1.5 mL棕色管
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超純水
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1mL
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1.5 mL藍色蓋
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使用手冊
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1份
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無
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
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注 意：首次使用本產(chǎn)品時需要在秀麗隱桿線蟲端粒酶底物干粉中加入55μL的超純水；秀麗隱桿線蟲TRAP引物-探針干粉管中加入165 μL的超純水。分別渦旋震蕩1分鐘溶解，短暫離心后放冰上待用。每次沒有用完的需要放-20℃保存。
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以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 在1-6號管中加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的秀麗隱桿線蟲TRAP檢測陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線陽性樣品。放冰上待用。
二：端粒酶的提取
注 意：端粒酶的組成成分中有RNA，極容易被降解，因此，提取端粒酶應(yīng)該跟提取RNA一樣，盡量在低溫條件下快速操作、最好使用本公司的固相RNase清除劑預先清潔試驗臺面等容易有RNase污染的地方。
7. 對冷凍的線蟲：將50-100 mg在-80℃冷凍的線蟲放裝有液氮的研缽中研磨成粉末，再轉(zhuǎn)移到預冷的玻璃勻漿器中，加入200 μL 預冷的TRAP專用細胞裂解液，溫和手動勻漿6次后冰浴30分鐘，每間隔5分鐘渦旋振蕩一次，然后直接進入第10步操作。
注意：為保證裂解效果，可在顯微鏡下觀察確保大部分細胞已經(jīng)裂解。如果線蟲樣品不足50-100 mg，可以按比例降低TRAP專用細胞裂解液用量。在-20℃保存的線蟲放置2個月后就失去端粒酶活性，而在-80℃保存的線蟲放置數(shù)年還有端粒酶活性。
8. 對新鮮的培養(yǎng)線蟲細胞：用自備的預冷PBS洗滌1E6個經(jīng)過胰酶處理的培養(yǎng)線蟲細胞或50-100 mg經(jīng)過胰酶處理的新鮮線蟲，3000 g 4℃離心5分鐘，棄上清，細胞沉淀可以直接使用，也可以放-80℃保存后續(xù)使用。在細胞沉淀中加入200 μL預冷的TRAP專用細胞裂解液，輕柔吹打3次懸浮細胞。對新鮮細胞：渦旋振蕩10秒后置冰浴30分鐘，每間隔5分鐘渦旋振蕩一次。對新鮮線蟲：在冰上用玻璃勻漿器輕柔勻漿后冰浴30分鐘，每間隔5分鐘渦旋振蕩一次。如果細胞不足1E6或50-100 mg，按比例降低TRAP專用細胞裂解液用量。
9. 14000 g 4℃離心20分鐘，收集160 μL上清（含端粒酶），留40 μL不取。
10. 取部分上清液用自備BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。
11. 測出各樣品的蛋白濃度后，用TRAP專用細胞裂解液將各樣品的蛋白濃度調(diào)成3 μg/μL，然后分裝合適的量到離心管中，將實驗所需的數(shù)量放冰上待用，其余的放-80℃長期保存（可存放一年）。此步所得樣本稱為端粒酶待測樣本。
12. 對每個樣本，一次實驗需要兩管，一管用于測定端粒酶活性，一管用作該待測樣本的熱滅活陰性對照。制備方式是每個樣本取一管端粒酶待測樣本，95℃處理10分鐘滅活端粒酶，放冰上待用。沒有用完的可放-80℃長期保存（可存放一年）供下次使用。
二：探針法TRAP20 μL體系
1. 確定端粒酶待測樣本的：為便于比較，每個反應(yīng)所用的蛋白量總量（或?qū)?yīng)的細胞數(shù)）必須一樣，否則不好進行樣本間的比較。
2. 設(shè)置反應(yīng)。如果有N個樣品，每個樣品做1次重復（一般建議作三個重復，此處為表述方便，假設(shè)只做1次重復），則需要準備2N+6個反應(yīng)管。多1倍是因為每個樣本都需要一個對應(yīng)的熱滅活陰性對照。另外1個用作探針法TRAP陰性對照，最后5個用于標準曲線樣本。按下表設(shè)置20μL體系的
三：結(jié)果分析
1. 實驗的有效性判斷：如果標準曲線樣本管的FAM信號結(jié)果為陰性（無Ct值，或者大于或等于35），則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重復實驗或跟廠家聯(lián)系。如果探針法TRAP陰性對照管的FAM信號結(jié)果均為陽性（有Ct值小于35），說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。如果標準曲線樣本管的FAM信號結(jié)果為陽性，探針法TRAP陰性對照管的結(jié)果為陰性，則實驗有效，可以進入下步分析。
2. 標準曲線制作：以5個標準曲線樣本濃度的log值為橫軸，以陽性對照（FAM通道）的Ct值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照的標準曲線為斜線，r2必須大于0.95。再以待測端粒樣品的Ct值從陽性對照的標準曲線上推算出待測端粒酶所合成的端粒重復序列的拷貝數(shù)的log值，再有此log值推算出新合成的端粒重復序列拷貝數(shù)。由于新合成的端粒DNA重復序列的拷貝數(shù)跟端粒酶的活性相關(guān)。因此端粒酶活性大小跟測試的Ct呈現(xiàn)反相關(guān)，同一次實驗所得的Ct值可以用來比較各所測各樣本中端?；钚缘南鄬Υ笮?。
自備試劑
樣品DNA，超純水，核酸純化試劑盒
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
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